Phát triển công cụ chẩn đoán không xâm lấn đối với bệnh tôm EMS

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) đã gây ra tình trạng họ tôm Penaeid nuôi ở các nước khác nhau ở Đông Nam Á và Mỹ Latinh bị chết với số lượng lớn. Bệnh gây ra sự hoại tử mô gan tụy do chất độc (pirA & Bvp) sản sinh bởi các dòng Vibrio parahaemolyticus đặc hiệu.

Ảnh minh họa

Việc chẩn đoán AHPND thường liên quan đến việc giết tôm để lấy mô gan tụy nhằm phân tích PCR (phân tích phản ứng chuỗi enzim kích thích sự tổng hợp DNA hoặc RNA – một kỹ thuật quan trọng cho phép các nhà khoa học phân tích một mẫu DNA). và/hoặc mô bệnh học. Tuy nhiên, phương pháp xâm lấn này rõ ràng là không thích hợp trong việc theo dõi tôm bố mẹ có giá trị, và các phương pháp không giết tôm sẽ được ưu tiên hơn. Các phương pháp không xâm lấn liên quan đến việc xét nghiệm phân tôm đã được sử dụng thành công để theo dõi các mầm bệnh nhiễm trùng đường ruột khác ở tôm.

Vì vi khuẩn AHPND hiện diện trong hệ thống tiêu hoá của tôm nhiễm bệnh, nên nghiên cứu này dựa trên khả năng thu thập các mẫu phân để theo dõi quần thể tôm mà không khiến tôm chết. Nghiên cứu này được tóm tắt từ ấn phẩm gốc trong Báo cáo Nuôi trồng Thủy sản 5 (2017 58-61), trong đó các nhà nghiên cứu đánh giá các thủ tục lấy mẫu phân tôm trực tiếp hoặc với việc bổ sung vi khuẩn hiện diện trong phân tôm thông qua việc nuôi cấy vi khuẩn.

Việc sử dụng phân tôm là mẫu chẩn đoán từ tôm không có triệu chứng bị bệnh

Thử nghiệm này được thiết kế để xác định xem liệu mẫu phân từ tôm con bị nhiễm bệnh AHPND có thể được sử dụng làm mẫu chẩn đoán hay không. Tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương, Penaeus vannamei, (4 tôm sạch bệnh (SPF), trọng lượng trung bình 8,5 gram) được cho ăn một lần với thức ăn cho tôm dạng viên ngâm trong môi trường nuôi cấy AHPND-V. parahaemolyticus (108 CFU/mL (tế bào/mL), liều dùng dưới tác động). Sau khi cho ăn, tôm được rửa với formalin-iodine (phooc – môn iốt) để khử trùng các vi khuẩn AHPND còn sót lại trong suốt thời gian tiếp xúc, và sau đó được đưa vào 4 bể riêng biệt.

Các sợi phân được thu thập trong thời gian thử nghiệm ba ngày; Sau đó, các nhà nghiên cứu chiết xuất DNA và tiếp theo là một PCR (phản ứng chuỗi enzim kích thích sự tổng hợp DNA hoặc RNA) AHPND nhằm mục tiêu đến cả hai gien độc tố, pirAvp và pirBvp. Kết quả cho thấy không có tôm chết trong suốt quá trình thử nghiệm. Khi thử nghiệm chấm dứt, tôm được xử lý để kiểm tra mô bệnh học và không phát hiện có tổn thương AHPND. Điều này cho thấy rằng phân tôm có thể được sử dụng làm mẫu chẩn đoán để theo dõi tôm cỡ lớn không có triệu chứng bệnh, mức độ lây nhiễm bệnh thấp.

So sánh độ nhạy PCR của các mẫu được chuẩn bị từ DNA lấy từ phân hoặc từ môi trường nuôi cấy được bổ sung vi khuẩn

Tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (80 con tôm, trọng lượng trung bình: 0,7 g) được sử dụng trong hai thử nghiệm ngâm nước, kéo dài 1 giờ và 6 giờ ngâm với nước chứa AHPND-V. parahaemolyticus. Trong mỗi lần thử nghiệm sinh học, các mẫu phân được thu thập sau 24 giờ. Một phần của mẫu phân được chiết xuất DNA và được sử dụng trực tiếp để phân tích PCR, và một phần của mẫu phân được nuôi cấy trong môi trường nước đậu tương (ở tỷ lệ 1: 1000) và ủ ở 28-29°C trong 6 giờ ; Nước này sau đó được sử dụng làm mẫu PCR mà không cần chiết xuất DNA.

Với thời gian ngâm 1 tiếng, tôm trong tình trạng gần chết vào ngày thứ 4, với tỷ lệ tử vong lũy tích là 45% khi thử nghiệm chấm dứt (ngày thứ 6). Mười mẫu phân được lấy mẫu và phân tích theo PCR: 7 mẫu lấy từ DNA đã chiết xuất có kết quả PCR dương tính cao, 4 mẫu dương tính yếu và một mẫu không phát hiện triệu chứng bệnh. Với thời gian ngâm 6 tiếng, tôm trong tình trạng gần chết vào ngày thứ nhất và tất cả tôm bị chết vào ngày thứ 2. Sự khuếch đại PCR mạnh được quan sát thấy trong cả chiết xuất DNA từ phân và từ môi trường nuôi cấy có bổ sung vi khuẩn.

Từ cả hai thử nghiệm sinh học trên, nghiên cứu chỉ ra rằng phương pháp bổ sung vi khuẩn có cường độ PCR mạnh hơn mẫu DNA từ phân, vì việc bổ sung vi khuẩn làm tăng đáng kể quần thể vi khuẩn. Độ nhạy tăng lên từ phương pháp bổ sung vi khuẩn có thể cản trở việc sử dụng PCR lồng nhau để phát hiện AHPND.

Triển vọng

Nghiên cứu cho thấy không phải tất cả tôm nhiễm bệnh đều chết do bệnh AHPND. Tương tự như vậy, ở các trang trại nuôi tôm, tôm bị nhiễm độc có thể hồi phục sau khi bị bệnh và trở thành những con tôm mang mầm bệnh nhưng không có triệu chứng bệnh. Việc chẩn đoán, sàng lọc và theo dõi AHPND thường liên quan đến việc giết tôm để lấy mẫu mô gan, một biện pháp không thích hợp để sử dụng với tôm bố mẹ có giá trị cao.

Thử nghiệm chẩn đoán mô tả ở trên cho AHPND không đòi hỏi phải giết tôm, đặc biệt là đối với những con tôm sống không có triệu chứng bệnh trong các quần thể tôm bố mẹ có giá trị. Thử nghiệm này liên quan đến phân tích PCR của môi trường nuôi cấy được bổ sung vi khuẩn từ các mẫu phân. Nước được bổ sung vi khuẩn có thể được sử dụng để phát hiện AHPND-V. Parahaemolyticus trong phân từ cả tôm trong tình trạng gần chết và tôm không có triệu chứng bệnh.

Những phát hiện này là mối quan tâm của các nhà sản xuất tôm trong việc xây dựng các chiến lược quản lý bệnh đối với loại bệnh AHPND và những phát hiện này sẽ cho thấy rất hữu ích trong việc chẩn đoán và giám sát AHPND ở các quần thể tôm nuôi.